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Test di ricircolo utilizzando un biocontenitore FlexGro^® dotato di un tubo pescante fisso per coltura in perfusione

Introduzione

I metodi a perfusione si stanno adottando rapidamente come alternativa alle colture tradizionali in batch e fed-batch delle cellule di mammifero. In un particolare tipo di sistema a perfusione, un bioreattore è collegato a un sistema di ricircolo attraverso il quale avviene il rinnovo dei terreni di coltura. I bioreattori a piattaforma basculante, comunemente definiti anche bioreattori oscillanti, sono un’opzione diffusa per applicazioni con volumi di lavoro inferiori ai 100 L, come l’inoculo delle colture cellulari e la produzione di proteine su piccola scala. Il movimento oscillante del reattore genera un’onda all’interno del biocontenitore monouso, che consente l’insufflazione della coltura cellulare ed evita sforzi di taglio elevati che possono rivelarsi problematici. Tuttavia, un inconveniente comune quando si usano bioreattori basculanti in modalità di perfusione è l’ingresso indesiderato di bolle d’aria all’interno del sistema di ricircolo. Queste bolle d’aria intrappolate compromettono l’efficacia del filtro di perfusione, che normalmente si ottiene tramite un dispositivo di filtrazione a flusso tangenziale o a flusso tangenziale alternato. In questo documento tecnico viene analizzata una soluzione che permette la coltura in perfusione tramite un nuovo tubo pescante fisso concepito per impedire il passaggio di bolle d’aria nel sistema di ricircolo. Un biocontenitore FlexGro^® da 50 L collegato a un circuito di ricircolo è stato testato allo scopo di rilevare la presenza di aria intrappolata in condizioni di lavorazione diverse per volume di liquido, frequenza di oscillazione e angolo di oscillazione. I dati sperimentali approfondiscono la relazione tra volume del liquido, frequenza di oscillazione e angolo di oscillazione, che è utile per definire l’intervallo operativo accettabile (PAR, cioè “proven acceptable range”) dei parametri di processo per il sistema a perfusione.

Materiali e metodi

Un biocontenitore FlexGro^® Meissner da 50 L (articolo n. B12R00505-006) modificato per poter inserire un tubo pescante fisso da 6,35 mm x 11,11 mm (ID x OD) (¼” x 7/16″) è stato montato su bioreattore basculante (GEHC, sistema Wave Bioreactor 20/50), riempito con acqua colorata e gonfiato con aria a circa 70 mbar (1 psi), secondo le istruzioni del produttore. È stato quindi realizzato un sistema di ricircolo composto da un tubo in silicone trasparente collegato ai tubi di ingresso e di uscita. Per mantenere la portata di ricircolo costante a 8 L/min è stata utilizzata una pompa peristaltica (Masterflex^® I/P). La preparazione del test è illustrata nella figura 1. Angoli di oscillazione tra 6° e 10°, frequenze di oscillazione tra 15 e 35 rpm e volumi di liquido tra 10 e 25 L sono stati utilizzati congiuntamente per stabilire se si verificava il trasferimento di bolle d’aria nel sistema di ricircolo. La tabella 1 riepiloga i parametri del test. Il sistema di ricircolo è stato sottoposto a un’ispezione visiva per individuare la migrazione di bolle d’aria nelle diverse condizioni operative in esame.

Risultati e discussione

Il grafico presentato nella figura 2 mostra la massima frequenza di oscillazione determinata in funzione dell’angolo di oscillazione e del volume di lavoro prima della migrazione dell’aria. Per simulare le condizioni più sfavorevoli e amplificare la migrazione di aria attraverso il tubo è stata scelta una portata di ricircolo di 8 L/min. Come ipotizzato, l’angolo di oscillazione, la frequenza di oscillazione e il volume di lavoro hanno influito sul passaggio di aria nel tubo. Un aumento nell’angolo di oscillazione e nella frequenza di oscillazione e una riduzione nel volume del liquido hanno contribuito a incrementare il passaggio di aria. Per impedire la migrazione dell’aria sono sembrate essenziali due condizioni: innanzitutto, il tubo pescante fisso deve rimanere sempre sotto il livello del liquido; in secondo luogo, il liquido in prossimità del tubo pescante non deve contenere bolle d’acqua. I tre parametri di funzionamento –volume, angolo di oscillazione e frequenza di oscillazione – hanno contribuito a influenzare la prima condizione. Sebbene il tubo pescante fisso fosse posizionato lungo la linea centrale del biocontenitore, in certe condizioni si è comunque verificato un intrappolamento di bolle d’aria, perfino con il volume di lavoro più alto, ossia 25 L. Quando la frequenza di oscillazione si è innalzata abbastanza (oltre 30 rpm per un angolo di 8° o maggiore), le forze inerziali generate hanno provocato lo spostamento oltre la linea centrale della gran parte dell’onda, il che ha comportato un abbassamento del livello di liquido sotto l’apertura del tubo pescante fisso. Il principale fattore che permette di soddisfare la seconda condizione è la frequenza di oscillazione. Con frequenze di oscillazione superiori, è aumentata l’agitazione, che a sua volta ha prodotto andamenti turbolenti e quindi bolle d’aria nel liquido. È probabile che in una coltura cellulare questo effetto si aggravi ulteriormente in seguito alla formazione di schiuma. Si prevede che il biocontenitore da 50 L utilizzato rappresenti la condizione più sfavorevole rispetto ai biocontenitori FlexGro^® più piccolo da 20 L e 10 L, perché si stima che l’effetto delle forze inerziali nel generare una miscelazione e un’agitazione turbolenta sia minore quando i volumi sono inferiori.

Conclusioni

Un biocontenitore FlexGro^® da 50 L modificato con un tubo pescante per formare un circuito di ricircolo è adatto all’utilizzo nelle applicazioni di coltura in perfusione, purché le condizioni operative rientrino nel PAR per evitare l’intrappolamento dell’aria. Per determinare un intervallo operativo normale dei parametri di funzionamento adeguati alla coltura in perfusione, può essere necessaria un’ulteriore valutazione sperimentale in condizioni di coltura cellulare reali. Pertanto, i risultati presentati in questo documento tecnico servono solo come indicazione per l’adozione dei biocontenitori FlexGro^® per la coltura in perfusione.

Per maggiori informazioni o per ricevere i dati del test, contatta Meissner Filtration Products.

Test del flusso di ricircolo Flexgro

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American Pharmaceutical Review: Tavola rotonda sulle tecnologie e attrezzature monouso

Questo articolo su American Pharmaceutical Review presenta le best practice in materia di implementazione delle tecnologie monouso, ma anche la comprensione delle conseguenze dell’esternalizzazione, da parte dell’utente finale, di funzioni che con i sistemi tradizionali venivano eseguite da personale interno. Sono evidenziati i modi più semplici per passare ai sistemi monouso, con un’attenzione particolare all’attuazione delle migliori pratiche per l’integrazione di attrezzature monouso e in acciaio inossidabile (sistemi ibridi). Vengono infine illustrate le previsioni sull’uso futuro dei sistemi monouso. Fanno parte del panel Max Blomberg, direttore delle operazioni, e Christian Julien, direttore di Pharma Process Solutions, nonché esperti di Finesse, BioPlan Associates, Pall Life Sciences, Thermo Fisher Scientific e Ulteemit BioConsulting.

A INTERPHEX New York 2016, Meissner presenta le innovazioni nei sistemi monouso e di filtrazione per ottimizzare la produzione biofarmaceutica.

Scopri le più recenti innovazioni che Meissner ha sviluppato per l’ottimizzazione della produzione nell’industria delle biotecnologie e farmaceutica. Max Blomberg, direttore delle operazioni, presenta l’iniezione sovrapposta modulare di BioLink^®, una tecnologia rivoluzionaria che riunisce tutti i vantaggi dell’iniezione sovrapposta tradizionale combinandoli con la rapidità e la flessibilità delle connessioni meccaniche tradizionali. I sistemi BioLink^® sono ottimizzati per le applicazioni monouso e permettono al team di ingegneri applicativi di Meissner di sviluppare sistemi monouso su misura degli specifici requisiti dell’utilizzatore finale, che si traducono in minori rischi di processo.

Christian Julien, direttore di Pharma Process Solutions, illustra il biocontenitore in PVDF FluoroFlex^® e in che modo può superare i limiti dei biocontenitori tradizionali a base di poliolefina. I biocontenitori FluoroFlex^® sono ottimizzati per soddisfare i requisiti più severi dell’industria farmaceutica e aprono nuove opportunità per i sistemi monouso. Per la produzione di questo film non sono necessari pacchetti di antiossidanti o di additivi: questo lo fa diventare un’alternativa ultrapulita ai film in poliolefina, con un profilo di sostanze rilasciabili ed estraibili estremamente basso. Proprio l’assenza di antiossidanti rende il biocontenitore FluoroFlex^® una soluzione dalle eccellenti prestazioni in applicazioni di coltura cellulare.

GEN Roundup: Il futuro dei filtri dipende dalla funzionalità

Questo articolo di Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN) riunisce specialisti della purificazione di bioprocessi coinvolti nella produzione biofarmaceutica a valle e presenta i loro punti di vista sui principali progressi in materia di filtrazione dei virus negli ultimi dieci anni e sui fattori necessari per una filtrazione su larga scala di successo ed economica. Il panel di esperti di GEN passa in rassegna i successi ottenuti, ma anche i compromessi obbligatori e gli studi futuri.

Il panel include Leesa McBurnie, manager dei servizi di laboratorio e di validazione in Meissner Filtration Products, nonché rappresentanti di GE Healthcare Life Sciences, MilliporeSigma, Pall Life Sciences, Sartorius Stedim Biotech e Spectrum Laboratories.

Rivista Pharmaceutical Technology: Innovation Outlook – L’espansione in orizzontale come chiave per lo scale-up

L’implementazione dei processi standard del settore normalmente rispetta una sequenza: parte dallo sviluppo di processo (PD), raggiunge la scala pilota e procede fino allo scale-up o produzione in serie. Questo processo sarà adottato ancora per un po’ di tempo, finché gli impianti per la produzione su larga scala tradizionali continueranno a essere pianificati e le attività di PD/pilota non diventeranno certamente obsolete. Ma lo scale-up tradizionale è messo alla prova dallo scale-out (l’espansione in orizzontale) e la norma accettata della produzione in serie sta cambiando. È certo che gli impianti tradizionali per la produzione su larga scala hanno la propria funzione nella produzione di prodotti biofarmaceutici. Tuttavia, esiste una tendenza di settore verso una capacità di produzione flessibile che offre molti vantaggi per le esigenze future: ad esempio, la rapidità di risposta in caso di pandemia, la pianificazione della capacità produttiva dei prodotti in base alle dinamiche della domanda del mercato legata alla concorrenza dei biosimilari, l’avvicinamento della produzione alle popolazioni colpite e infine la produzione di farmaci per piccole popolazioni di pazienti man mano che le terapie per specifiche malattie diventano più personalizzate. Per soddisfare tali bisogni, considerati i progressi nelle concentrazioni nei processi fed-batch e l’avvento di processi di produzione continua, lo scale-out, ossia la semplice replica di un dato processo a un volume fisso, è spesso una soluzione migliore e più efficiente rispetto allo scale-up.

La tendenza a trattare popolazioni di pazienti sempre più contenute con terapie specifiche per una determinata malattia sta portando in ultima analisi alla medicina personalizzata. La fabbricazione di queste terapie, nonostante le caratteristiche comuni a livello di lavorazione, richiede per natura processi di produzione con un’espansione orizzontale (scale-out), con la replica ripetuta più e più volte di un processo simile, a un certo volume. Lo scale-out trae vantaggio dall’uso dei sistemi monouso (SUS, o “single-use systems”) – e in un certo modo ne dipende. Questi sistemi non sono nuovi, ma quando trovano applicazione in contesti di scale-out, nei quali sono richieste quantità maggiori di SUS relativamente più piccoli per applicazioni sempre più complesse e critiche, le problematiche comuni associate possono acuirsi. Queste sfide comprendono la capacità di implementare in modo rapido e ripetuto i SUS, considerazioni di tipo logistico e la capacità di avviare una supply chain robusta che assicuri la consegna costante di prodotti che soddisfano rigorose specifiche di qualità. È inoltre essenziale che esistano prodotti adeguati con dimensioni proporzionali alla scala del processo. Quello che una volta poteva essere un piccolo filtro da laboratorio ora può essere un filtro critico per la fase di produzione e pertanto deve essere supportato nella medesima maniera delle varianti più grandi per i processi tradizionali su larga scala. Meissner risponde a queste esigenze con nuovi prodotti di filtrazione progettati specificamente per la piccola scala.

I processi su scala orizzontale inoltre traggono vantaggio da livelli migliori di automazione, che spesso sono necessari per i processi stessi. Per i produttori di farmaci, questo permette l’esecuzione di un numero maggiore di processi, normalmente in parallelo, e con modalità operative potenzialmente migliorate. Analogamente, anche la catena di fornitura a supporto dei processi su scala orizzontale deve essere più automatizzata; ciò vale sia per la fornitura di soluzioni di processo integrate che per lo sviluppo di metodi di produzione dei consumabili e di tecnologie. Fattori di stimolo dell’automazione, comuni sia ai produttori di farmaci che alla catena di fornitura, includono il raggiungimento di una maggiore solidità di processo, il rapido aumento della capacità e la possibilità di codificare dati di produzione aggiuntivi. Per questo motivo, Meissner sta sviluppando soluzioni di lavorazione unitaria altamente automatizzate nonché tecnologie di connessioni monouso di prossima generazione: queste devono essere in grado di sostituire le connessioni meccaniche assemblate a mano con connessioni termiche permanenti generate tramite processi interamente automatizzati.